全长微生物多样性
产品介绍
三代微生物多样性是基于?PacBio 测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法对 marker 基因进行测序，之后通过对 CCS（Circular Consensus Sequencing）序列过滤，得到 Optimization-CCS 进行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成； 进一步进行α多样性分析（Alpha Diversity）、β多样性分析（Beta Diversity）和显著物种差异分析等等，可以挖掘?样品之间的差异。
目前，微生物多样性研究主要是于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区，真菌主要基于18S区或ITS区（内转录间区），16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列。这些序列中既有保守区又有可变区，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。由于18S rDNA在进化速率上比较保守，在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。常用作微生物分类研究的ITS分为ITS1和ITS2两种。ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列的18S和5.8S之间，ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。由于ITS区在核糖体RNA加工过程中被剪切掉，不发挥功能作用，在进化过程中选择压力较小，进化速率约为18S rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外，也可通过选择引物同时扩增18S rDNA和ITS，通过分析18S rDNA序列，先在较高级别上确定样品的归属，然后根据ITS 序列，将真菌归类到种或亚种水平。
我们对不同类型的样品如：土壤、粪便、肠道、水体等，随机挑选了30个项目对其进行物种注释率进行研发优化，目前采用优化数据库及注释方法的策略，将其种水平平均注释率提升到60%+。二代注释到属和种的平均比例为78%和6%，相同样品采用三代进行注释时，属和种水平平均注释率为95%和60%，注释结果提升非常明显。
测序数据量饱和度
三代微生物多样性是基于PacBio测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法对marker基因进行测序。PacBio的CCS模式minPasses≥5，自我矫正，超高准确性。通过对校正后的CCS（Circular Consensus Sequencing）进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析。可以揭示环境样品中物种构成，进一步进行Alpha Diversity、Beta Diversity和组间显著物种差异分析等，可以挖掘样品之间种类和丰度的差异。
统计数据结果显示：单样本5000条CCS即可达到饱和。
工作流程
建库测序：
提取样品总 DNA 后，根据 16S 全长引物 27F 和 1492R（及其他全长引物），合成带有 Barcode 的特异引物，进行 PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 PacBio Sequel 进行测序。PacBio Sequel下机数据为 bam 格式,通过 smrtlink 分析软件导出 CCS 文件, 根据 Barcode 序列识别不同样品的数据并转化为 fastq 格式数据。
生信流程：
数据预处理：将 PacBio 下机数据导出为 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具获取)后，主要有如下3个步骤：
1)CCS识别：使用?lima v1.7.0软件，通过barcode对CCS进行识别，得到的Barcode-CCS序列数据；
2)CCS长度过滤：使用gd视讯公司自主研发的软件，对Barcode-CCS进行过滤，得到有效序列；
3)去除嵌合体：使用?UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到 Optimization-CCS 序 列。
信息分析内容：划分OTU、多样性及差异性分析（具体见分析结果）。
结果展示
送样要求
土壤：每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样量
淤泥：4小时内常温带回实验室中分装至2mL EP管或冻存管中；或用PBS进行清洗，8000g离心10min收集沉淀，分装于2 mL离心管中；每个样品至少2g。
水体：2ml-5ml水体，取样后4小时内（期间4 ℃避光保存）真空抽滤、富集菌体（平行重复 样本可用同一滤膜过滤0.22μm或0.45μm）带有富集菌体的干燥滤膜剪碎或折叠后保存在 2mL或5mL 无菌EP管中。
肠道内容物：在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的内容物。用无菌手术刀挖取内容物，并立即放在冰上进行分装及标记。将已取的样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
粪便：带上手套收集新鲜的粪便样品，无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解，将已取的粪便样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
所有样本，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输
生物学重复≥3
DNA样本：
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项目类型 |
浓度 |
总量 |
纯度 |
完整性 |
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微生物多样性 |
≥10ng/μL（Qubit） |
≥500ng |
扩增条带正常 |
主带清晰，无降解或轻度降解 |
引物列表：
| 内容 | 项目 | 引物名称 | 序列 | 扩增产物长度 |
| 全长 | 16S 全长 | 27F | 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ | 1.5K |
| 1492R | 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ | 1.5K | ||
| 18S全长 | EukA | 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′ | 1.8K | |
| EukB | 5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′ | 1.8K | ||
| ITS 全长 | ITS1 | 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ | 0.6-0.7K | |
| ITS4 | 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ | 0.6-0.7K |
案例展示
案例一：水体16S全长
2019年7月，德国的莱布尼茨动物园和野生动物研究所在Scientific Reports上发表运用16S全长的方法研究污水厂流入与流出水体的菌群特性的文章。
废水处理对城市环境中的环境卫生至关重要。然而，废水处理厂（WWTP）收集化学物质，有机物和微生物，包括来自各种来源的病原体和多重抗性细菌，这些细菌可能通过污水处理厂的污水释放到环境中。为了更好地了解污水处理厂的微生物动态，我们使用全长16S rRNA基因序列对德国柏林污水处理厂2月、4月、7月和10月的污水厂流入与流出水体的细菌群落进行了研究和比较。通过污水处理厂处理过程，疾病相关细菌群体的相对丰度从有效性降低，只有军团菌和钩端螺旋体从流入物到流出物的相对比例增加。这表明污水处理厂虽然对肠道细菌有效，但可以富集并释放其他潜在致病菌进入环境中。
案例二：硅藻18S全长多样性
2017年美国的北卡罗来纳大学通过对从西南极半岛分离出的9种硅藻通过形态学表征性状及18S测序鉴定硅藻种类。
研究表明铁氧还蛋白，favodoxin，铁蛋白，视紫红质，质体蓝素，替代线粒体氧化酶，细胞色素c6和ISIP基因存在于大多数（但不是全部）硅藻分支中。最终，通过研究基因库及生理属性，我们可以开始发现影响硅藻分布和丰度的其他细胞机制。
案例三：ITS全长多样性
2019年，高通量测序技术的发展极大地有益于我们对微生物生态学的理解，但产生短读取的方法受到物种水平分辨率和不确定性的影响。在这里，我们优化基于太平洋生物科学的元条码编码协议，涵盖内部转录间隔区（ITS区域）和rRNA基因的部分小亚基，用于物种水平鉴定所有真核生物的阳离子，特别关注真菌（包括Glomeromycota）和Stramenopila（特别是Oomycota）。
基于对爱沙尼亚复合土壤样品和模拟群落的测试，我们提出了最适合的简并引物，ITS9munngs + ITS4ngsUni用于真核生物及其中的选定组，并讨论了基于长读取的真核生物鉴定的利弊。
常见问题
Beta多样性四种距离算法的差异？
Beta?多样性分析主要采用?binary jaccard、?bray curtis、?unweighted Unifrac(限细菌)、weighted Unifrac?(限细菌)等4种算法计算样品间的距离，那么这四种算法都有什么差别呢？
非加权的计算方法，主要考虑的是物种的有无，即如果两个群体的物种类型都一致，表示两个群体的样本距离最小；加权方法，则同时考虑物种有无和物种丰度两个问题。比如如样品A由3个物种a和2个物种b组成，样品B由2个物种a和3个物种b组成，则通过非加权方法计算，因为样品A与样品B的物种组成完全一致，都只由物种a和b组成，因此它们之间的样本距离为0。但通过加权方法计算，虽然样品A与样品B的物种组成一致，但物种a和b的数目却不同，因此两个群体的β多样性则并非一致。
基于独立OUT的方法认为OTU之间不存在进化上的联系，每个OTU间的关系平等；基于系统发生树计算的方法，会根据16s的序列信息对OTU进行进化树分类， 因此不同OTU之间的距离实际上有“远近”之分。
微生物多样性中OTU是指什么？
OTU（Operational Taxonomic Unit ）即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在微生物多样性分析中，根据不?同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，一般情况下，如果序列之间的相似性高于97%?（种水平）就可以把它定义为一个OTU，每个OTU代表一个物种。
PCA与PCoA的区别？
主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一种分析和简化数据集的技术，通过将方差进行分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上；主坐标分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一种与?PCA?类似的降维排序方法。PCoA与PCA的区别在于PCA是基于原始的物种组成矩阵所做的分析，使用的是欧式距离，仅仅比较的是物种丰度的不同，而PCoA首先根据不同的距离算法计算样品之间的距离，然后对距离矩阵进行处理，使图中点间的距离正好等于原来的差异数据，实现定性数据的定量转换。
