黄瓜是人们生活中常见的新鲜果蔬,深受大众消费者喜欢。今天给大家推荐的这篇文章是前不久扬州大学陈学好老师课题组的最新研究成果“The major-effect quantitative trait locus Fnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber”,该研究报道了一个黄瓜果把长度调控的主效基因,并阐述其遗传机制,最终该成果发表在国际知名期刊Plant Biotechnology Journal(最新IF=8.15)。该文章采用的思路和方法,从事植物发育类性状研究的老师们可以借鉴,其中最重要的基础工作BSA定位由gd视讯生物提供。

针对本篇项目案例,大师兄将分为2部分给大家介绍,今天先为大家奉上该文章的解读,从整体上了解文章的研究成果,第二部分大师兄将以其中主效基因的初定位和精细定位过程为基础,对基因精细定位方法做详细介绍,敬请期待。

研究背景

黄瓜果把长度(fruit neck length,FNL)是影响黄瓜品质和商业价值的重要性状之一,由于果把无肉质组织、有苦味,而且易被折断,因此现代育种的方向是短把黄瓜。关于黄瓜果把长度的遗传特征研究较少,多篇文章报道了数个QTL位点,而且这些QTL解释的表型变异率变化较大,但是相关基因一直没有被克隆。

研究内容

本研究首先通过长果把品种Jin5-508和短把品种YN杂交构建的性状分离群体(F2和F2:3),从F2中选择果把长度极端个体构建DNA混池进行高通量测序,BSA分析和传统遗传图谱共同在7号染色体上定位到一个主效QTL。再通过分离群体精细定位、基因表达分析、转基因验证等方法确定了调控果把长度基因CsFnl7.1。同时发现CsFnl7.1启动子区域的多态性调控CsFnl7.1的表达水平。结合自然群体材料的多样性分析,发现CsFnl7.1位点可能起源于印度。

文章思路

主要结果

01 黄瓜果把长度的遗传特征

授粉30天后,双亲Jin5-508和YN黄瓜果把长度不再增长,于是选择该时间节点作为果把长度鉴定的时期(图1a)。Jin5-508果把长度显著长于YN,这种差异是因为Jin5-508果把果肉细胞体积大于YN,而非细胞数增多(图1b,c,d,e)。统计F1群体、回交群体和F2群体果把长度发现,F1群体表现出中亲表型,而回交群体表型更偏向于轮回亲本,F2群体表现出连续的近正态分布(图1f),以上结果表明黄瓜果把长度是数量性状。

图1?黄瓜果把长度遗传特征

02果把长度QTL的初定位—BSA方法+遗传图谱

作者在1231个F2群体(Jin5-508 × YN)选择了长把和短把单株各50个,构建2个极端性状DNA混池,对该混池及双亲进行高通量测序及BSA分析。亲本测序深度分别为34x(Jin5-508)和20x(YN),混池测序深度分别为61x和52x。测序数据与黄瓜参考基因组9930比对,2个混池分别开发了342,496和399,764个SNP,基于SNP index算法,在chr7上定位到一个主效QTLFnl7.1?(阈值0.833),区间范围9.98–14.61 Mb(图2c)。

图2?BSA定位结果

为验证BSA的定位结果,作者在3个不同环境下调查了102个F2:3家系(Jin5-508 ×?YN)的表型,结果显示F2:3表型也符合正态分布(图3a)。基于双亲重测序数据,作者在7号染色体上开发了72个双亲多态标记(SNP和InDel),用这些标记合F2群体构建7号染色体的连锁图谱。结合F2:3群体3个环境的表型以及F2遗传图谱,共同定位到了1个主效QTL(图3b),表型贡献率在27.9%-32.7%。综合BSA定位和遗传图谱定位结果,最终吧QTL Fnl7.1定位在7号染色体上2.85Mb的区间内。

图3?F2:3群体表型变异及遗传图谱定位结果

03 Fnl7.1的精细定位

作者利用初定位侧翼标记InDel01和SNP01对大规模F2单株(4000株)进行分型,筛选得到51个区间重组单株。在InDel01和SNP01区间内又开发了另外4个标记,对51个重组单株进行分型,共得到10种不同的单体型,基于个体表型及单体型数据,Fnl7.1被缩小到25.4kb的区间(标记InDel05和SNP01)(图4c)。为了进一步缩小区间范围(老师态度很严谨,佩服),作者又构建了一个更大规模的F2分离群体(7600个单株),利用InDel05和SNP01进行分型后又得到4个F2重组单株。F2重组单株自交得到4个F2:3群体,在InDel05–SNP01区间内又开发了4个多态SNP标记,用这些标记对F2:3群体进行筛选,发现有2个F2:3群体在标记区间内发生了重组。利用重组单株的表型及单倍型分型结果,将Fnl7.1定位在14.1kb的区间(图4d),而在该区间内共有2个基因,分别为CsGy7G014720和CsGy7G014730(图4e)。

图4?Fnl7.1精细定位过程

04 Fnl7.1功能验证

克隆双亲14.1kb定位区间,测序后进行序列比对发现共有17个SNP和InDel差异,部分变异位于基因间区、内含子区,而位于外显子区的则为非同义突变,另外在CsGy7G014720启动子区有多个变异。同时,作者发现InDel05(位于CsGy7G014720启动子区)与Fnl7.1共分离。以上结果表明,CsGy7G014720(后续称作CsFnl7.1)是最有可能的候选基因。

选择双亲授粉后0-15天幼瓜进行CsFnl7.1的表达量分析,qRT-PCR结果显示授粉后6个时间点,CsFnl7.1在双亲中表达差异不显著,而且表达量表现出持续降低(图5a)。但是,在授粉当天,CsFnl7.1在Jin5-508中表达量显著高于YN。组织特异表达分析显示,CsFnl7.1在果把中表达量最高(图5b)。?

图5?CsFnl7.1表达分析

05 CsFnl7.1启动子多态性影响其表达

序列分析显示,双亲CsFnl7.1启动子区存在多处序列差异(25个SNPs和7个InDels),因此作者将双亲的启动子进行了克隆,分别与GUS基因构建整合质粒,转化烟草叶片进行启动子活性分析。发现Jin5-508启动子(pCsLEAJ)活性是YN启动子(pCsLEAY)活性的4倍(图6)。这与转录组分析结果一致(授粉当天CsFnl7.1在Jin5-508表达量显著高于YN),从而说明CsFnl7.1表达受顺式调控。

图6?双亲CsFnl7.1启动子活性比较

06? CsFnl7.1转基因植株表现

为进一步验证基因功能,作者将CsFnl7.1转入短把品种“D8”中,得到3个T2代单株(OE4、OE7和OE8)。Southern杂交显示OE4、OE7和OE8分别插入1、1和2个拷贝(图7a)。与对照相比,3个转基因个体CsFnl7.1表达量显著提高,同时果把长度也更长,说明CsFnl7.1确实能够影响果把长度(图7b,c,d)。分析果把果肉细胞的个数和大小发现,转基因个体比对照个体细胞更大,但细胞数在两者之间没有显著差异(图7e,f,g),从而说明CsFnl7.1是通过调控细胞伸展来影响果把长度。

图7?CsFnl7.1转基因个体表现

07? CsFnl7.1与细胞伸展相关蛋白存在互做

利用酵母双杂技术,以CsFnl7.1蛋白为诱饵筛选与其互做的蛋白,结果显示共得到53个阳性克隆,在这些蛋白中有多个与细胞伸展相关,包括CsDRP6和CsGLP1(图8a)。体外pull down实验显示,融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕获,而对照GST则不能(图8b)。以上结果充分说明CsFnl7.1与CsDRP6、CsGLP1之间存在互做关系。

图8?酵母双杂及pull?down分析

08? Fnl7.1的地理分布及进化分析

作者收集了158份自然群体黄瓜材料,来自于东亚、欧亚大陆、印度、西双版纳等,含野生种和栽培种,东亚品种大多为长果把,而欧亚大陆品种大多为短把,而印度品种长果把和短果把品种数量相当,这也反映了Fnl7.1位点可能起源于印度。

利用Fnl7.1启动区的变异信息,对158个品种进行进化分析,结果显示所有品种可被分为4个group,其中group1和group2主要包含来自于欧亚大陆的端果把品种,而group3主要为来自于东亚的短果把品种,来自印度多个品种在3个不同group都有分布,以上结果也可以证实Fnl7.1起源于印度的假说。

总结

本文是一篇典型的基因克隆+验证的优秀文章,从事农作物、蔬菜功能基因研究的老师可以引用参考。该研究最大的亮点是使用大规模F2分离群体,通过BSA分析+重组个体分析,就实现了基因的精细定位,从而避免了构建高代回交群体的繁琐过程,极大地缩短了基因克隆的周期,减少了多年杂交、标记筛选等工作流程。当然,能够采用这种策略,也与物种繁殖周期、产籽量、QTL贡献率等多个因素相关(我们会在下期着重讨论这些问题),本研究的物种和性状特征符合上述要求,所以能够快速拿到基因。在这篇文章之前,2018年陈学好老师在The Plant Journal(最新IF=6.14)上发表了一篇黄瓜耐水淹基因克隆验证的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1?encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”,文章思路和方法与本文基本相似,也是采用大规模F2分离群体+BSA分析的方式,感兴趣的老师可以参考学习。我们不难看出,只要方法选的对,再加上细致的研究工作,就可以持续发表高分文章!

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参考文献

Xu, X., Wei, C., Liu, Q., Qu, W., Qi, X., Xu, Q.and Chen, X. (2020) The major-effect quantitative trait locusFnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber. Plant Biotechnol. J., https://doi.org/10.1111/pbi.13326

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